天津南昌气相色谱和液相色谱微型化中的关键问题

      目前分析仪器微型化的浪潮汹涌澎湃,人们以极大的热情投入到这个浪潮中。从世界各地的实验室里出现的原理型样机看上去是如此的微小、简洁和令人惊诧,有如此多的加工工艺可以应用在微型器件的加工和组合上从非常昂贵的、在超净房间才能使用的精密仪器设备和工艺到土法上马、在普通房间就能操作的加工手段。它的前景是那样的诱人,引无数英雄一试身手。
　　从1986 年我第一次听说微型（天津/南昌）气相色谱仪并看到相关文章,就认定它是色谱发展的未来。1987 年底我在荷兰第一次看到它时,就下决心今生一定研究微型色谱,因为它从观念上、认识上打开了分析仪器微型化的大门。
　　真正开始研究微型气相色谱(μ2GC) 是在1992年的春天,从715 万元的经费和国内无辅助加工条件的困难境地开始的。至今,科技部、国家自然科学基金委、中国科学院、前国家教委、辽宁省科委和本单位对我们研究组在微型色谱仪方面的投入已有300 万,我们研制的微型气相色谱仪已经在2002 年6 月通过科技部的攻关课题验收。目前在国家自然科学基金委仪器研制专项基金的支持下,正在进行阵列式微型液相色谱/ 电色谱的研究工作。10 年多的科学实践使我认识到:要进行色谱仪器的微型化,首先要对色谱仪器和色谱原理有十分深入的认识,不仅从化学上,更要从基本的物理知识、统计热力学、材料学、力学、数学、机械和电子器件制造技术上全面认识;要对色谱仪器的每一个部件和零件的原理、材料、设计、尺寸等因素对部件或器件性能的影响有深入的定量的研究,以及它们对整机性能的定量影响。
　　在（天津/南昌）色谱仪器微型化过程中,尺寸的缩小不仅要考虑材料的性质和制造上的可能,还要从原理上考虑尺寸缩小后所带来的一系列问题。这些问题包括: (1) 分离系统中被分配的分子个数是否大于106 ,因为只有大于106 才能得到符合统计结果的数据;(2) 因分离通道尺寸缩小,自然提高了单位柱长的效率,但是总长度的减少可能使总分离效能远低于常规仪器; (3) 对于质量敏感型检测器,经过分离柱后单位时间内到达检测器的分子个数是否满足检测原理所要求的最小数目; (4) 对于浓度型检测器,到达检测池的分子数目是否能满足符合统计规律的分子数目; (5) 检测微区内的外加能量密度是否超过被检测分子所能承受的极限; (6) 微量流动相的输送与控制; (7) 因材料尺寸的缩小,表面层氧化或腐蚀对器件功能的影响。最后,色谱仪器微型化所带来的好处不仅仅是单位长度分离效率的提高,而是总分离能力的保持甚至提高;不仅仅是分离系统或某个部件的微型化,而是整体的微型化;不仅仅是质量灵敏度的提高,而是浓度灵敏度的保持或提高;不仅仅是能量和物质的低消耗,而是使用的方便和友好;不仅仅是整体尺寸的缩小,更重要的是整机的稳定性和可靠性的提高!

下面分别讨论上述7 个问题。
　　(1) （天津/南昌）色谱分离的基本原理是有符合统计规律数目的分子群经过不断的两相分配和分子碰撞,利用其分配系数的差异来达到分离的目的。这是一个宏观参数。当分子数目低于这个数目时,就会偏离统计规律而出现所谓的涨落现象。分子数目越少,涨落现象越严重。当分子数目低于103 个时,已没有准确的色谱保留规律,因此也就失去了宏观意义下的分离规律。一般地,保证符合统计规律的分子数目是106 个。
　　例如内径30 μm 的填充毛细管（天津/南昌）液相色谱(μ2HPLC) 柱或毛细管电泳柱,若分别保持10 万/ m 和40 万/ m 的分离柱效,直接进样时不过载的进样量分别为40 pL (1 pL = 10 - 12 L) 和115 pL ,分子总数分别是112 ×1012～112 ×1014和415 ×1010～415 ×1012 。样品中含量低至1～0. 01μL/ L (对μ2HPLC) 或低至20～0. 2μL/ L (对CE) 的组分就不能满足106 个分子的数目要求,分离过程中就会出现上述问题。所以,上述分离系统对浓度高于这个指标的样品分离时可以有重复的保留时间。如果考虑检测方面的限制[参见下述的(3) 和(4) > ,痕量分析中用粗内径的填充色谱柱总是优于微型色谱柱。
　　为了能进行痕量分析,微型分离分析系统往往采用样品预浓缩技术以补偿浓度灵敏度的不足。但为此而发展的技术也同样适用于常规分离分析系统,同样可以提高常规仪器的灵敏度,除非样品量受到严格限制。
　　(2) 45 年前的色谱柱理论已经指出,毛细管开口柱的内径越小,或填充柱的填料粒度越小,色谱柱的分离效率就越高。毛细管电泳亦然,只是理论上有些不同,如有散热问题和塞子流型的特点。微型化中普遍采用的细内径分离柱并不是微型仪器的专利,所能达到的高柱效也不是最近才认识到的。如果在现有常规仪器中使用这种等效内径的色谱柱,再适当改进进样技术和检测器,就会有与微型色谱或芯片电泳同样的单位柱长的柱效,同时还可以有极高的总分离效能,因为常规仪器中分离柱的长度很少受限,而高的分离效能才是真正有意义的。所以,微型色谱和芯片毛细管电泳用短分离柱而有快速分离的特点,并不是它真正的优点,因为用同样尺寸的分离柱可以分别在常规色谱和毛细管电泳上实现同样的效果。用现有的思维模式来进行的色谱仪器微型化,导致了使用短分离柱,而且所有的应用例子都是用极简单的样品,这是因为这样的微型化仪器的总分离效能太低。
　　(3) 质量型检测器的响应值与单位时间内进入检测器的样品分子数成正比。分离柱的样品容量与柱内径的3 次方(毛细管开口柱) 或平方(填充柱) 成正比。例如气相色谱FID 检测器,用内径50μm 的毛细管柱只能分析样品中含量为011 %(1 000 ppm)以上的组分;而用内径530μm 的毛细管柱能分析样品中含量为3 ×10 - 7 (013 ppm) 以上浓度的组分,相差3 000倍。虽然细内径色谱柱的谱带宽度(表现为色谱峰宽度) 比粗内径色谱柱的窄,能增加单位时间内的分子数目,但它是与柱径的平方根(本质上是柱效的平方根关系) 成正比;与柱容量的减少比,仍然亏215 次方。离子化检测器和荧光检测器都是质量型的,离子化效率一般在10 - 5～10 - 3 ,荧光产率一般在10 - 3 ,所以单位时间内进入检测器的分子数目必须大于50 ×103～50 ×105 ,具体数值取决于检测器的性能。用浓度型检测器会极大地改善这种状
况,因为响应值主要与目标组分的浓度有关。
　　特殊的质量型检测器,如具有单分子检测能力的激光诱导荧光检测器和热透镜检测器等,已用于CE 和μ2HPLC。但是他们绝对不是微型化的设备,也不是一台色谱仪或电泳仪的价格所能买到的。
　　在痕量分析中,用直接进样方式和质量型检测器时,常规色谱总是优于微型色谱。
　　(4) 从宏观上讲,浓度型检测器的响应值与进入检测池内样品分子的总数无关,而只与样品分子和流动相分子数的比值有关。例如,用50 μm 和530μm内径的毛细管柱和池体积为012μL的热导检测器(μ2TCD) 检测,最小检出浓度分别为2 ×10 - 5 (体积分数) 和2 ×10 - 6 (体积分数) ,仅差10 倍。而后者单位时间内进入检测池中的分子数目比前者多3 ×103倍。所以微型色谱和微型流动分析仪器中用浓度型检测器有利。但是这个理论是有限度的。如在CE 和μ2HPLC 中,当分离柱内径≤75μm、塔板高度≤10μm 时,要求检测池体积在nL 级(10 - 8～10 - 9L) ,用吸收光谱检测器(浓度型检测器) 时,上述理论不再成立。因为从微观看,检测的原理是利用样品分子的某种特性,当分子数目不满足检测原理所要求的统计数目时,表现为噪声信号。所以在上述的微型分离系统中,最小检出浓度是很高的,远不如常规分离系统的低。
　　就检测器本身而言,微型化会影响它的响应灵敏度。如气相色谱用的热导检测器,由于给定气体的热导率与通道的壁间距( d) 有关, 特别是在d ≤015 mm 时,热导率随d 的减小而呈几何增加,因此微型化使热导检测器的灵敏度有大幅度提高。所以,微型化研究应选择那些在原理上有利于保持或提高灵敏度的检测器,或者研究那些有极高检测灵敏度的检测器微型化问题,如激光诱导荧光检测器。
　　(5) 检测微区内的外加能量问题。任何检测原理和技术都是依赖样品分子与外加能量的相互作用而产生的物理信号。由于检测微区达到μm 级,而作用到微区的光或电磁波强度往往比常规检测器高几倍到几万倍,以此弥补因样品分子数减少而损失的信号2噪声比值。例如,吸收光谱检测器或荧光光谱检测器等常规检测器的光斑直径在500～1 000μm ,而μ2HPLC 或μ2CE 的检测器光斑直径仅有30μm ,甚至5μm ,但所用的光源功率往往是相同的,经过聚焦,达到检测区的光强度提高了3 个数量级甚至更高。在这样小的微区内,如此高的光强度会产生如下问题:液体汽化、荧光物质“漂白”、被检测分子变性、响应非线性等。