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黄曲霉毒素M1 ELISA检测试剂盒
961AFLM01M
概况
黄曲霉毒素(Aflatoxin, AF）是由多种霉菌代谢的毒性产物，例如Asperillus flavus 和Asperillus parasiticus霉菌。他们具有致癌性，存在与谷物、坚果、棉籽和其他人类商品食物中或动物饲料中。谷物可能被黄曲霉毒素的衍生物：B1、B2、G1和G2其中一种污染或者被多种毒素污染。AFB1是目前检测到的最毒的毒素。其他类型毒素如果污染的浓度很高也存在很大的危险。黄曲霉毒素能够引发人类很多病症包括肝癌、黄曲霉中毒、莱耶综合症和慢性肝炎。动物容易摄取到黄曲霉毒素，原因是动物吃的饲料在生长、收割和贮存过程中能被黄曲霉毒素产生的真菌毒素污染。当奶牛吃了被污染的饲料，AFB1在体内羟基化转化成AFM1，AFM1常在牛乳中被检测到。如果牛初乳中存在AFM1，针对一般的牛奶处理方法例如巴氏杀菌，但AFM1是非常稳定的，它可能一直留存到人类最终消费产品中。世界上大多数国家的政府已经对人类和动物性食品中制定了严格的黄曲霉毒素限量标准。很多国家已经声明降低牛奶和奶制品中的AFM1限量标准。欧盟已经将牛奶和奶制品中AFM1的限量定为0.05ug/L或者50ppt。
使用目的
HELICA AFM1 分析测定试剂盒目的是用来定量检测牛奶、奶粉和乳酪中的AFM1。
分析原理
HELICA AFM1 分析测定是一种固相竞争酶联免疫分析测定方法。聚苯乙烯微孔板中包被抗AFM1的高亲和力抗体。将标准品或者样品加入合适的微孔中，如果存在AFM1，它将和包被的抗体结合。接下来，加入HRP（辣根过氧化物酶）标记的毒素，标记毒素与标准品或者样品与抗体没有结合的部位相结合。孵育一段时间后，倒出孔里的液体，清洗后加入显色底物，在酶的作用下孔里将会出现蓝色。显色颜色的深浅与结合物的量成正比例的关系，与标准品或样品中AFM1的量成反比例关系。所以，标准品或样品中的AFM1浓度越高，显色的蓝色将会越浅。加入酸，终止反应，底物颜色由蓝色变为棕黄色。微孔板放进酶标仪里，在OD450nm 读取吸光度值。样品的吸光度值与试剂盒中标准OD值相比较，相对应得出结果。
试剂盒组成
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1×小袋
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抗体包被的微孔板
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96孔板（12×8微孔板用鼠源AF单克隆抗体）
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6×小瓶
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AFM1标准品
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3.0mL/瓶，AFM1的浓度分别为0.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0, 100.0pg/mL(ppt)
溶解在稳定脱脂乳中。
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1×小瓶
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HRP-AF偶联物
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绿色盖子
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15mL HRP-AF 添加防腐剂的缓冲溶液，可以直接使用
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1×小瓶
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底物试剂
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蓝色盖子
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15mL 稳定的尿素过氧化氢物和TMB，可以直接使用
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1×小瓶
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终止液
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红色盖子
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15mL 酸性液体，可以直接使用
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1×小袋
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洗液
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PBST （PBS中加入0.05% 吐温20），溶解在1L蒸馏水中，贮存在冰箱
中待用
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1×小瓶
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M1 脱脂乳
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白色盖子
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15mL 脱脂乳用来制备乳酪提取物
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分析检测操作步骤
1、使用前将试剂拿到室温。
2、将装试剂的小袋开封，根据待测的标准品和样品的数量取出一定量的微孔。
3、将不使用的微孔重新放入小袋，封好口避免潮湿的空气进入。（分析检测完毕微孔支架将来可以继续使用。）
4、每次都要使用新吸头，吸取200μL 标准品或样品加到两个复孔里。
5、将板子装入袋子中封口，避免水蒸气挥发和紫外光的照射。
6、在室温（19℃-25℃）下孵育2h。
7、将孔里的液体倒入合适的容器中，从洗瓶里吸取PBST洗板或用多道洗板洗孔，然后迅速弃掉洗液到合适的容器中，重复洗3次。在一层厚的吸水纸上拍板，去掉残留的洗液。
8、每个孔中加入100μL的偶联物（绿色盖子）。
9、再次用袋子封好板子，室温下孵育15min。
10、重复步骤7。
11、每个孔中加入100μL 酶反应底物（TMB）孵育15-20min。
12、加入100μL的终止液终止反应，板中颜色将会由蓝色变为棕黄色。
13、450nm 下读取每个孔的吸光度值（OD），使用一个空白对照或者使用不同的630nm下滤光片。
可选择的孵育操作
第一次孵育标准品和样品阶段，可以在4℃-6℃过夜，显著的改善样品为5ppt和更大浓度时0浓度抑制结合率。如果选择这个步骤，接下来偶联物和TMB的孵育可以在室温下进行。
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孵育温度
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ng/L
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过夜（4℃-6℃）, 结合率%
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室温下2h, 结合率%
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0
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100.0
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100.0
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5
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83.8
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89.0
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10
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67.5
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80.1
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25
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37.4
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55.5
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50
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19.8
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36.3
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100
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12.5
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21.2
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检测极限规定为2ppt（ng/L）, 2个标准偏差低于0浓度检测结果的平均OD值(n=18, CV<2%)。
结果分析
使用原有的OD值或实验获得的OD值与标准曲线中AFM1浓度为0时OD值的百分比值建立剂量效应曲线。通过在标准品曲线中添加新数值计算被测物质中AFM1的浓度。
标准品和样品获得的平均吸光度值除以标准品浓度为0时的吸光度值乘以100，标准品浓度为0时为100%，其他标准品和样品吸光度值都以这样的形式表示。
标准品吸光度值（或样品）/标准品0浓度时吸光度值×100=%吸光度值
标准品数值输入到坐标图的坐标系统中，计算AFM1的浓度ng/L。根据相应的吸光度值每个样品都能从坐标曲线中读出AFM1的浓度含量ng/L。
为了获得样品中AFM1的精确含量ng/L数据，从标准曲线读取的浓度应该乘以相应的稀释倍数。牛奶样品乘以1，乳酪样品乘以5。
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